Kasvivirukset esiin pikku-RNA -sekvensoinnilla

Kasvin viruspuolustuksen seurauksena syntyvien pienten ribonukleiinihappomolekyylien (RNA) sekvensoinnin avulla voidaan tunnistaa kerralla kaikki kasvissa olevat virukset. Menetelmän käyttöönotto kasvinterveyden valvonnassa auttaa tulevaisuudessa estämään virusten aiheuttamia taloudellisia tappioita.

Kasvivirukset aiheuttavat kasvintuotannossa satotappioita sekä kasvien heikentyvän kasvun että sadon laadun alenemisen vuoksi. Esimerkiksi kurkun vihermosaiikkivirus saattaa tuhota koko kurkkukasvuston, jolloin satoa ei saada lainkaan. Perunan maltokaarivirus puolestaan ei yleensä juurikaan vähennä mukulasatoa, mutta mukuloiden pinnalle ja sisäosiin muodostuu kuoliokaaria, jotka pilaavat sadon laadun vaikeuttaen mukuloiden käyttöä elintarviketeollisuudessa.

Taloudellisesti tehokkain tapa torjua kasviviruksia on ennaltaehkäisy. Virusten leviämistä pyritään estämään kasvinterveyttä koskevalla lainsäädännöllä, jonka nojalla voidaan tarkastaa maahan tuotavaa ja markkinoilla olevaa kasvimateriaalia sekä kartoittaa kasvintuhoojien, kuten virusten, esiintymistä tuotantopaikoilla. Tarkastusten ja kartoitusten yhteydessä kasveista otetaan näytteitä, jotka tutkitaan virallisissa kasvintarkastuslaboratorioissa. Suomessa tällainen laboratorio on Ruokaviraston Laboratorio- ja tutkimuslinjan Kasvianalytiikan laboratorio.

Yksittäistesteistä kokonaisvaltaiseen analyysiin

Kasvivirusten tunnistaminen oireiden avulla on epäluotettavaa, koska eri virusten aiheuttamat oireet muistuttavat usein toisiaan, ja toisaalta sama virus voi aiheuttaa eri kasvilajeissa ja -lajikkeissa hyvinkin erilaisia ja voimakkuudeltaan vaihtelevia oireita.

Perinteisesti viruksia on tunnistettu erilaisilla virus- tai virusryhmäkohtaisilla viruksen perimää monistavilla (polymeraasiketjureaktio, PCR) ja viruksen kuoriproteiineja tunnistavilla (entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys, ELISA) testeillä, ja näytteistä on tutkittu ennalta sovitut tai oireiden perusteella todennäköiset virukset.

Kasveilta on kuitenkin tähän mennessä löydetty satoja erilaisia viruksia, joten kaikkia kasvia mahdollisesti infektoivia viruksia ei ole taloudellisesti järkevää tutkia viruskohtaisilla testeillä, eikä satojen testien ylläpito laboratoriossa ole käytännössä edes mahdollista. Virallisissa kasvintarkastuslaboratorioissa ylläpidetään testejä lähinnä lainsäädännössä mainituille tai muuten erityisen haitallisille kasviviruksille.

Kasvit tunnistavat kaikki niitä tartuttavat virukset RNA-hiljennykseksi kutsutun puolustusmekanismin avulla. RNA-hiljennyksessä kasvin puolustusmekanismi tunnistaa virusperäisiä RNA-rakenteita ja pilkkoo niitä lyhyiksi RNA-molekyyleiksi (pikku-RNA) pyrkien näin estämään virusinfektion etenemisen. Riippumatta siitä, miten tehokkaasti viruksen lisääntyminen estyy, kasviin kertyy RNA-hiljennyksen seurauksena pikku-RNA:ta kaikista sitä infektoivista viruksista.

Kasvista voidaan laboratoriossa eristää siihen kertyneet pikku-RNA:t, joiden emäsjärjestys eli sekvenssi voidaan selvittää syväsekvensointilaitteilla. Sekvensoinnin tuloksena saaduista miljoonista lyhyistä sekvenssipätkistä voidaan bioinformatiikan keinoin koostaa kokonainen viruksen perimä tai osa siitä. Näitä koostesekvenssejä voidaan verrata tietokannoissa oleviin virussekvensseihin ja tunnistaa kerralla kaikki kasvia infektoivat virukset. Lisäksi menetelmällä voidaan löytää tieteelle täysin tuntemattomia viruksia.

Tieteellisestä tutkimuksesta rutiinidiagnostiikkaan

Pikku-RNA:n hyödyntäminen kasvivirusdiagnostiikassa keksittiin vuonna 2009, ja se omaksuttiin laaja-alaisuutensa vuoksi nopeasti tieteellisen tutkimuksen välineeksi. Menetelmän rutiinikäyttö kasvinterveyslaboratoriossa vaatii kuitenkin parhaiden toimintatapojen määrittämistä, vakioimista ja validointia. Näin varmistetaan, että testi toimii toistettavasti ja luotettavasti.

Elintarviketurvallisuusvirasto Evira (nykyisin osa Ruokavirastoa) oli jo vuosina 2013−2016 mukana maatilatalouden kehittämisrahaston (Makera) rahoittamassa projektissa, jossa yhdessä Helsingin yliopiston ja Luonnonvarakeskuksen kanssa selvitettiin pikku-RNA -sekvensoinnin käyttökelpoisuutta kasvinterveyden valvonnassa. Projektin tärkeintä antia oli menetelmän herkkyyden vertaaminen nykyisin käytössä olevaan PCR-menetelmään.

Vertailussa selvisi, että pikku-RNA -analyysin avulla voidaan todeta yhtä pieniä virusmääriä kuin PCR-menetelmillä. Euroopan tieteen ja tekniikan yhteistyöohjelman rahoittamassa Deep Investigation of Virus Associated Sequences -hankkeessa vuosina 2015−2018 selvitettiin 28 osallistujamaan ja useiden eurooppalaisten kasvintarkastuslaboratorioiden voimin parhaita käytäntöjä muun muassa pikku-RNA -analyysin toistettavuuden ja luotettavuuden varmistamiseen. Tulosten pohjalta Euroopan ja Välimerenmaiden kasvinsuojeluorganisaatio EPPO on laatimassa ohjeistusta laboratorioille, jotka haluavat ottaa menetelmän käyttöön rutiinidiagnostiikassa.

Ruokavirastossa pikku-RNA -analyysin käyttöönotto alkoi toden teolla viime vuonna silloiseen Eviraan hankitun syväsekvensointilaitteen ja perunan viruksiin liittyvän Makera -hankkeen (Virukset suomalaisessa perunantuotannossa – yleisyys ja tartunnan lähteet) myötä.

Hankkeen aikana on tarkoitus selvittää perunantuotannon virustilanne ja validoida menetelmää kasvintarkastuslaboratorion käyttöön. Tulevaisuudessa pikku-RNA -analyysiä voidaan käyttää esimerkiksi vihannes- ja marjakasvien taimiaineiston virusvapauden varmistamiseen ja siten torjua ruuantuotannon määrällisiä ja laadullisia satotappioita.